摘要：目的 探讨苦丁冬青苷 D （KD-D） 对人 HCC-1806 乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及机制。方法 将人 HCC-1806 乳腺癌细胞作为研究对象，给予不同浓度 KD-D 处理后，采用 CCK-8 法检测细胞存活率； EdU 法检测细胞增殖能力；结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力；流式细胞术 （Annexin V-FITC/PI 法） 检测细 胞凋亡；JC-1 染色法检测细胞线粒体膜电位；免疫荧光法检测细胞 Cleaved Caspase-3、LC3、P62 蛋白表达； Western Blot 法检测细胞 Cleaved Caspase-3、Pan-AKT、Phosp-AKT、LC3Ⅱ蛋白表达；自噬双标 mRFP-EGFP- LC3 腺病毒感染实验检测细胞自噬流。结果 与对照组比较，12.5、25、50、100、200、400 μmol·L-1 KD-D 处理 HCC-1806 细胞 24、48 h 后，随着给药浓度增大和处理时间延长，细胞活性显著降低 （P＜0.001） ，细胞 内吸光度值显著降低 （P＜0.001） ，细胞增殖受到抑制；60、80 μmol·L-1 KD-D 组的细胞克隆形成计数显著减少 （P＜0.001） ；50、100、150 μmol·L-1 KD-D 组细胞的早期及晚期凋亡比例均显著升高 （P＜0.05，P＜0.001） ； 40、60、80 μmol·L-1 KD-D组的红色荧光比例显著下降 （P＜0.001） ，绿色荧光比例显著升高 （P＜0.01，P＜0.001） ， HCC-1806 细胞线粒体膜电位下降；60、80、100 μmol·L-1 KD-D 组细胞的 Cleaved Caspase-3 蛋白表达均显著 上调（P＜0.001），60 μmol·L-1 KD-D 组细胞的 Pan-AKT、Phosp-AKT 蛋白表达均显著上调（P＜0.001）； 60 μmol·L-1 KD-D 组细胞的 LC3 蛋白荧光小点数量显著增加 （P＜0.001） ，P62 蛋白平均荧光强度显著降低 （P＜0.001） ，LC3Ⅱ蛋白表达显著上调 （P＜0.001） ，自噬小体及自噬溶酶体数量显著增加 （P＜0.01，P＜0.001） ， 自噬流激活。与 60 μmol·L-1 KD-D 组比较，KD-D+AKT 抑制剂（Afuresertib）组细胞的 Cleaved Caspase-3、 Pan-AKT 蛋白表达显著下调 （P＜0.01，P＜0.001） ，Phosp-AKT 蛋白表达显著上调 （P＜0.001） 。结论 KD-D 能抑制人乳腺癌 HCC-1806 细胞增殖，并诱导其发生凋亡和自噬，KD-D 诱导 HCC-1806 细胞凋亡可能与激活AKT 信号影响 Cleaved Caspase-3 表达有关。

Objective To investigate the effect and mechanism of kudinoside D （KD-D） on proliferation， apoptosis and autophagy of human HCC-1806 breast cancer cells. Methods Human HCC-1806 breast cancer cells were treated with different concentrations of KD-D，and the cell viability was detected by CCK-8 method. EdU method was used to detect cell proliferation ability；the ability of cell clone formation was detected by crystal violet staining. Apoptosis was detected by flow cytometry （Annexin V-FITC/PI）. Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining. The protein expressions of Cleaved Caspase-3， LC3 and P62 were detected by immunofluorescence. The protein expressions of Cleaved Caspase-3， Pan-AKT， Phosp-AKT and LC3 Ⅱ were detected by Western Blot. Autophagy double-labeled mRFP-EGFP-LC3 adenovirus infection assay was used to detect cell autophagy flow. Results Compared with the control group，HCC-1806 cells were treated with 12.5，25， 50，100，200，400 μmol·L-1 KD-D for 24 and 48 hours. With the increase of drug concentration and treatment time，the cell activity was significantly decreased （P＜0.001），the intracellular absorbance value was significantly decreased（P＜0.001），and the cell proliferation was inhibited. The cell clone formation counts in 60 and 80 μmol·L-1 KD-D groups were significantly decreased （P＜0.001）. The proportion of early and late apoptosis in 50，100， 150 μmol·L-1 KD-D groups were significantly increased（P＜0.05，P＜0.001）. The proportion of red fluorescence in 40， 60 and 80 μmol·L-1 KD-D groups were significantly decreased （P＜0.001）， the proportion of green fluorescence was significantly increased（P＜0.01，P＜0.001），and the mitochondrial membrane potential of HCC- 1806 cells decreased. The protein expression of Cleaved Caspase-3 in 60，80，100 μmol·L-1 KD-D group were significantly up-regulated （P＜0.001），and the protein expressions of Pan-AKT and Phosp-AKT in 60 μmol·L-1 KD-D group were significantly up-regulated （P＜0.001）. In the 60 μmol·L-1 KD-D group，the number of LC3 protein fluorescent dots was significantly increased （P＜0.001），the average fluorescence intensity of P62 protein was significantly decreased （P＜0.001），the expression of LC3Ⅱ protein was significantly up-regulated （P＜0.001），the number of autophagosomes and autolysosomes were significantly increased （P＜0.01，P＜0.001），and the autophagic flow was activated. Compared with 60 μmol·L-1 KD-D group，the expression of Cleaved Caspase-3 and Pan-AKT protein in KD-D + AKT inhibitor （Afuresertib） group was significantly down-regulated （P＜0.01， P＜0.001），and the expression of Phosp-AKT protein was significantly up-regulated （P＜0.001）. Conclusion KD-D can inhibit the proliferation of human breast cancer HCC-1806 cells and induce apoptosis and autophagy. The apoptosis of HCC-1806 cells induced by KD-D may be related to the activation of AKT signal and the expression of Cleaved Caspase-3.

R285.5

国家自然科学基金项目 （81402818）；安徽省教育厅高校科学研究项目 （YJS20210556）